液相色譜儀的校準方法

1. 液相色譜儀的概述

液相色譜儀是由輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統等部分組成的分析儀器。液相色譜儀根據樣品中各組分在色譜柱內固定相和流動相間分配或吸附等特性的差異，由流動相將樣品帶入色譜柱中進行分離，經檢測器檢測并通過數據處理系統記錄色譜圖，依據各組分的保留時間和響應值(峰面積或峰高)進行定性和定量分析。

2. 計量性能要求

(1)      輸液路接口緊密牢固，在規定的壓力范圍內無泄漏。

(2)      泵流量設定值誤差和流量穩定性應符合下表的要求。

(3)      梯度最大允許誤差：士3%。

(4)      柱溫箱溫度設定值最大允許誤差：±2℃。

柱溫箱溫度穩定性：不大于1℃/h。

(5)      該儀器的計量性能應符合下表的要求：

3.計量器具校準

（1）環境條件

室溫為（15~30）℃，校準過程中溫度變化不超過3℃（對示差折光率檢測器，室溫變化不超過2℃），室內相對濕度：（20~85）%；室內不得存放易燃、易爆和強腐蝕性的物質，無機械振動和電磁干擾，通風良好。

（2）校準使用標準物質

a.  萘-甲醇溶液標準物質：認定值為1.00×10^-4g/mL，擴展不確定度小于4%， K=2；

b.  萘-甲醇溶液標準物質：認定值為1.00×10^-7g/mL，擴展不確定度小于4%， K=2；

c.  甲醇中膽固醇溶液標準物質：認定值為200μg/mL，擴展不確定度小于2.0%， K=2；

d.  甲醇中膽固醇溶液標準物質：認定值為5.0μg/mL，擴展不確定度小于5.0%， K=2；

e.  膽固醇純度標準物質：認定值為99.7%，擴展不確定度小于0.1%， K=2。

（3） 液相色譜儀的校準項目

1) 外觀檢測

2) 輸液系統

a.  泵耐壓

b.  泵流量設定值誤差

c.  泵流量穩定性

d.  梯度誤差

3) 柱溫箱

a.  溫度設定值誤差

b.  溫度溫度性

4) 檢測器

a.  基線噪聲

b.  基線漂移

c.  最小檢測濃度

d.  波長示值誤差和重復性

e.  線性范圍

5) 整機：定性、定量重復性

（4）外觀檢查

用目測、手動法進行檢查。

（5）輸液系統

a.  泵耐壓：將儀器各部分連接好，以100%甲醇(或純水)為流動相，流量為0.2 mL/ min，按說明書啟動儀器，壓力平穩后保持10 min，用濾紙檢查各管路接口處是否有濕跡。卸下色譜柱，堵住泵出口端(壓力傳感器以下)，使壓力達到最大允許值的90%，保持5 min應無泄漏。

b.  泵流量設定值誤差和流量穩定性：按要求設定好流量，啟動儀器，壓力穩定后，在流動相出口處用事先稱重過的潔凈容量瓶收集流動相，同時用秒表計時，收集規定時間內流出的流動相，在分析天平上稱重，計算流量實測值，重復測量3次。

c.  梯度誤差：由梯度控制裝置設置階梯式的梯度洗脫程序，A溶劑為純水，B溶劑為含0. 1%丙酮的水溶液。將輸液和檢測器連接(不接色譜柱)，開機后以A溶劑沖洗系統，基線平穩后開始執行梯度程序，畫出B溶劑經由5段階梯從0%變到100%的梯度變化曲線。求出由B溶劑變化所產生的每一段階梯對應的響應信號值的變化值，重復測量2次，計算結果。

（6）柱箱溫度設定值誤差和穩定性校準

a.  將數字溫度計探頭固定在柱溫箱內與色譜柱相同的部位，選擇35℃和45℃ (也可根據使用溫度設定)進行校準；

b.  按儀器說明書操作，通電升溫，待溫度穩定后，記下溫度計讀數并開始計時，以后每隔10 min記錄1次讀數，共計7次，求出平均值。

c.  平均值與設定值之差為柱溫箱溫度設定值誤差，7次讀數中最大值與最小值之差為柱溫箱溫度穩定性。

（7）檢測器校準（以紫外-可見光檢測器和二極管陣列檢測器為例）

a.  波長示值誤差和重復性

將檢測器和數據處理系統連接好，通電預熱穩定后，用注射器將純水注入檢測池內進行沖洗后，充滿檢測池。待檢測器示值穩定后，在(235土5) nm、(257士5) nm、(313士5) nm和(350士5) nm的波長下將示值回零，然后再用注射器將紫外分光光度計溶液標準物質(參考波長為235 nm，257 nm，313 nm和350 nm)從檢測器入口注入樣品池中沖洗，并將樣品池充滿至示值穩定。將檢測器波長調到低于參考波長5nm處(例如檢定257 nm時，檢測器波長先調到252 nm)，改變檢測器波長，每(5 ~10) s改變1 nm,記錄每個波長下的吸收值，最大或最小吸收值對應的波長與參考波長之差為波長示值誤差。每個波長重復測量3次，其中最大值與最小值之差為波長重復性。

b.  基線噪聲和基線漂移

選用C₁₈色譜柱，以100%甲醇為流動相，流量為1.0 mL/min，紫外檢測器的波長設定為 254 nm，檢測靈敏度調擋。開機預熱，待僅器穩定后記錄基線 30min，選取基線中噪聲最大峰-峰高對應的信號值，計算基線噪聲。

c.  最小檢測濃度

在基線噪聲和基線漂移的色譜條件下，由進樣系統注入(10~ 20) μL的1.00×10-7g/mL萘-甲醇溶液，記錄色譜圖，由色譜峰高和基線噪聲峰高，計算最小檢測濃度。

d.  線性范圍

將檢測器和數據處理系統連接好，檢測器波長設定為254 nm，通電穩定后，用注射器直接向檢測池中注射2%異丙醇-水溶液沖洗檢測池至示值穩定后，記下此值。然后，依照上法向檢測池中依次分別注入丙酮-2%異丙醇系列水溶液(丙酮含量為0.1%，0.2%，…，1.0%)，并記下各溶液對應的穩定響應信號值，每個溶液重復測量3次，取算術平均值。以5個丙酮溶液濃度(0.1%，0.2%，0.3%， 0.4%，0.5%)和對應的響應信號值做標準曲線，在曲線上找出丙酮溶液濃度大于0. 5%各點的讀數，與相應各濃度點的測量值做比較，量值相差5%時的依度作為檢測上限。按得到的最小檢測濃度為檢測下限，他們的比值即為線性范圍。

（8）定性和定量重復性校準

將儀器各部分聯接好，選用C₁₈色譜柱，用100%甲醇為流動相，流量為1.0mL/min，根據儀器配置的檢測器，選擇相應的測量參數如紫外可見光檢測器和二極管陣列檢測器波長設定為254 nm，靈敏度選擇適中，基線穩定后由進樣系統注入一定體積的1.0×10^-4 g/mL萘-甲醇溶液標準物質，其他檢測器選擇相應的參數。連續測量6次，記錄色譜峰的保留時間和峰面積，最后計算相對標準偏差。

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