細(xì)胞計(jì)數(shù)儀驗(yàn)證

1．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀概述

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞濃度檢測(cè)的儀器，目的是為了明確培養(yǎng)的細(xì)胞在某一時(shí)間段的密度，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液，以便其能夠良好生長(zhǎng)，一般以每毫升細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞/ml）來(lái)表示計(jì)數(shù)結(jié)果。那么這就需要測(cè)量死細(xì)胞和活細(xì)胞的濃度，在細(xì)胞中，細(xì)胞死亡是正常的，總細(xì)胞數(shù)中活細(xì)胞所占的百分比稱(chēng)為細(xì)胞活力，也可叫做存活率。對(duì)細(xì)胞活力的應(yīng)用可用于對(duì)復(fù)蘇后細(xì)胞凍存和復(fù)蘇效果的檢測(cè)，也可用于在組織中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離時(shí)是否存在損傷的檢測(cè)。現(xiàn)在常用的對(duì)細(xì)胞死活的辨別方法是通過(guò)使用臺(tái)盼藍(lán)，臺(tái)盼藍(lán)染色的原理是活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞能夠染色，另一個(gè)是熒光染色法來(lái)鑒別。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀有兩個(gè)重要的功能，一個(gè)是計(jì)數(shù)，另一個(gè)就是對(duì)細(xì)胞是否死亡的判斷。目前市場(chǎng)上有兩類(lèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：一類(lèi)是明場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀僅需簡(jiǎn)單的臺(tái)盼藍(lán)染色，另一類(lèi)是熒光場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，需要相應(yīng)的熒光染料。

2．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的原理

(1)      臺(tái)盼藍(lán)染色原理（明場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：臺(tái)盼藍(lán)是細(xì)胞跨膜染料，活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，臺(tái)盼藍(lán)無(wú)法通過(guò)，細(xì)胞呈中心透亮具有明顯的輪廓。死細(xì)胞膜通透性改變，臺(tái)盼藍(lán)可跨過(guò)死細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞顏色加深，呈現(xiàn)實(shí)心的圓點(diǎn)與活細(xì)胞中心透亮輪廓清晰有明顯的差異，根據(jù)這種形態(tài)的差異可以明顯區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別計(jì)數(shù)。

(2)      AO/PI 熒光染色原理（暗場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：AO/PI 為細(xì)胞核染料，AO 為吖啶橙是一種小分子染料，可以跨過(guò)所有細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使有核細(xì)胞標(biāo)記上綠色熒光。PI 是碘化丙啶一種大分子染料，只有細(xì)胞死亡膜通透性改變后才能跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞的核標(biāo)記上紅色熒光。AO/PI 染細(xì)胞后，死細(xì)胞會(huì)同時(shí)染上 AO 和 PI，AO 的發(fā)射光波長(zhǎng) 532 nm 左右，PI 的激發(fā)光波長(zhǎng)剛好與 AO 發(fā)射光波長(zhǎng)相重，兩種染料同染上死細(xì)胞核時(shí)會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，AO 的發(fā)射光被 PI 吸收，所以死細(xì)胞只會(huì)顯示紅色熒光，而活細(xì)胞只有綠色熒光。因此，通過(guò)特異性染色的細(xì)胞上標(biāo)記的紅色熒光和綠色熒光就可以快速辨別出死細(xì)胞和活細(xì)胞。

注：AO/PI試劑由可以發(fā)出綠色熒光的DNA結(jié)合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡(jiǎn)稱(chēng)AO）和可以發(fā)出紅色熒光的DNA結(jié)合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，簡(jiǎn)稱(chēng)PI）組成。

3．為什么細(xì)胞計(jì)數(shù)儀要做驗(yàn)證呢？

首先應(yīng)該明確做驗(yàn)證的目的，就是為了保證使用的儀器檢測(cè)出的結(jié)果數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可信。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目的儀器，對(duì)其準(zhǔn)確度要求很高，比如它的重復(fù)復(fù)現(xiàn)結(jié)果的能力、穩(wěn)定性等等。新儀器使用前以及儀器使用一段時(shí)間后都需要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，保證檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果準(zhǔn)確、可信，就必須對(duì)它的安裝、環(huán)境等各部分系統(tǒng)要求進(jìn)行驗(yàn)證，以證明該儀器符合檢測(cè)的目的和要求，產(chǎn)生的誤差也在規(guī)定范圍內(nèi)。那么儀器驗(yàn)證就是對(duì)儀器各功能進(jìn)行檢測(cè)、驗(yàn)證使其滿足使用者的要求。這就需要通過(guò)設(shè)計(jì)合理的預(yù)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該儀器是否符合檢測(cè)樣品的規(guī)定要求，復(fù)現(xiàn)性怎么樣、準(zhǔn)確度會(huì)不會(huì)有偏移，結(jié)果是否可信等。所以儀器驗(yàn)證就是為了保證所檢測(cè)出的結(jié)果是否可信、準(zhǔn)確，這是很有必要的，只有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)。

4．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀驗(yàn)證項(xiàng)目

（1）安裝確認(rèn)

a. 文件確認(rèn)

b. 附件確認(rèn)

c. 安裝環(huán)境確認(rèn)

d. 安裝情況確認(rèn)

（2）運(yùn)行功能確認(rèn)

a. 運(yùn)行功能確認(rèn)

b. 軟件控制功能測(cè)試

（3）性能確認(rèn)

a. 準(zhǔn)確度測(cè)試

b. 線性關(guān)系測(cè)試

c. 重復(fù)性測(cè)試

d. 細(xì)胞活率判定測(cè)試

5．注意事項(xiàng)

(1)      每次使用前檢查檢出室或檢出器細(xì)孔是否被污染，檢出器細(xì)孔是否被損壞，細(xì)胞計(jì)數(shù)定量隔膜泵和檢出器之間的管道是否堵塞等；

(2)      取樣計(jì)數(shù)前，充分混勻細(xì)胞懸液，使分散成單個(gè)細(xì)胞；

(3)      如果感覺(jué)細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)，可以從細(xì)胞懸液中吸取10μL至100μL，用少量PBS稀釋后再作計(jì)數(shù)；

(4)      上機(jī)前注意檢查是否有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑校?/span>

(5)      所用的稀釋器、吸樣管要經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)；

(6)      檢測(cè)前試樣混勻很重要，如果無(wú)旋轉(zhuǎn)式混勻器應(yīng)顛倒混勻至少8次；

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